Michele Vitolo
Đại học Khoa học Dược phẩm, Đại học Tổng hợp São Paulo, Brazil.

NGHE ĐỌC

TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME


Enzyme có nguồn gốc động vật và thực vật được tạo ra bằng cách tạo ra các mô, cơ quan, lá và trái cây - thường là các nguyên liệu còn sót lại từ hoạt động chăn nuôi và nông nghiệp của gia súc -, sau đó được chiết xuất bằng nước hoặc dung môi hữu cơ. Mặt khác, enzym vi sinh vật thu được từ tế bào nhân sơ (vi khuẩn) hoặc tế bào nhân thực (chủ yếu là nấm men) được nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc bán rắn và được thực hiện trong một lò phản ứng đặc biệt gọi là lò lên men. Quá trình này được gọi là quá trình lên men.

Quá trình nuôi cấy bán rắn - được sử dụng trên quy mô lớn lần đầu tiên vào năm 1894 để sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae được trồng trong khối gạo nấu chín ẩm trong một tuần (“Quy trình Koji”) xảy ra như sau: a) dạng bán rắn môi trường (ngô, lúa mì, đậu nành, gạo, hoặc cám lúa mạch) chịu các tia hơi để nấu chín và khử trùng; b) môi trường bán rắn được phân bố đồng đều trong các khay được cấy chủng vi sinh vật thuần khiết, thường là nấm; và c) quá trình lên men diễn ra trong điều kiện vô trùng trong một tuần. Môi trường lên men bán rắn có chứa enzym mong muốn có thể được xử lý bằng một trong hai quy trình. Nếu muốn chuẩn bị enzyme thô, môi trường lên men bán rắn được đưa trực tiếp vào quá trình làm khô, nghiền và sàng, sau đó là tiêu chuẩn hóa và đóng gói sản phẩm cuối cùng. Quá trình khác bao gồm gửi môi trường lên men bán rắn để chiết xuất trong nước, lọc, ly tâm, kết tủa, tinh chế, làm khô, ổn định, tiêu chuẩn hóa và đóng gói sản phẩm cuối cùng. Quá trình bán rắn hiệu quả để thu được các enzym ngoại bào (pectinase, amylase và cellulase) được vi sinh vật bài tiết vào môi trường.

Trong môi trường nuôi cấy chìm, vi sinh vật được giữ ở trạng thái huyền phù thông qua sự khuấy động liên tục trong các điều kiện phát triển có kiểm soát (pH, nhiệt độ, chất dinh dưỡng, oxy hóa, v.v.) Môi trường là dung dịch nước bao gồm các chất chi phí thấp như thủy phân tinh bột, mật đường, ngô dốc. rượu, váng sữa và nhiều loại ngũ cốc. Khi kết thúc quá trình lên men, enzym có thể có trong vi sinh vật hoặc được bài tiết vào môi trường. Khi bên trong tế bào, huyền phù được ly tâm hoặc lọc, phần nổi phía trên hoặc dịch lọc được thải ra ngoài và thu nhận bánh tế bào; nếu không, bánh tế bào bị loại bỏ và pha lỏng được thu thập. Tùy thuộc vào enzym trong hoặc ngoài tế bào, quá trình lên men phải được thực hiện theo cách tương ứng với sự phát triển của tế bào.



TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH XỬ LÝ BƯỚC ĐẦU:
Xử lý bước đầu là một số hoạt động đơn vị nhằm mục đích cô đặc và tinh sạch một enzym thường có trong dịch chiết thô. Các hoạt động đơn vị chính được sử dụng là phá vỡ tế bào (nếu cần), lọc, ly tâm, lắng, tạo bông, đông tụ, siêu lọc, kết tủa, sắc ký, kết tinh, bay hơi, làm khô, chuẩn hóa và đóng gói.
Nhiệm vụ đầu tiên trong việc xây dựng chiến lược hạ nguồn là xác định độ tinh khiết cần thiết của enzym. Phạm vi cho phép của nồng độ tạp chất và các tạp chất cụ thể có thể dung nạp sẽ được quyết định bởi việc sử dụng cuối cùng của chất xúc tác. Tất cả các sản phẩm men vi sinh được sử dụng trong thực phẩm hoặc thuốc đều phải đáp ứng các yêu cầu nghiêm ngặt về độ tinh khiết liên quan đến độc tính. Hiện nay, chỉ có một số ít vi sinh vật được sử dụng để sản xuất enzyme. Nhà sản xuất chịu trách nhiệm về sự an toàn của sản phẩm enzyme. Trên thực tế, một sản phẩm enzym an toàn phải không gây dị ứng và không chứa các chất độc hại và vi sinh vật gây bệnh. Thu hồi enzyme chiếm một phần lớn của sản phẩm và / hoặc chi phí sản xuất.

Lọc.
Tốc độ truyền chất lỏng qua bộ lọc phụ thuộc vào sự chênh lệch áp suất được áp dụng, sức cản của vật liệu lọc, độ nhớt của chất lỏng và lực cản tạo ra bởi bánh đã có sẵn. Do đó, hiệu quả của bộ lọc ban đầu sẽ cao, nhưng sẽ giảm xuống khi vật liệu tích tụ và có thể nén. Chất hỗ trợ lọc, chẳng hạn như đất tảo cát, giữ lại các hạt mịn hơn và có giá trị trong việc phân lập enzym, nhưng chúng có xu hướng làm tắc dịch chứa enzym và sẽ làm hỏng thiết bị hạ lưu nếu được phép đi vào dịch lọc. Vật liệu silic là một mối nguy hiểm cho sức khỏe và phải được xử lý cẩn thận, đặc biệt là khi khô.
Các hình thức phổ biến nhất của bộ lọc công nghiệp là máy ép tấm và khung và bộ lọc trống quay. Trước đây bao gồm các tấm vải lọc bị mắc kẹt giữa các tấm tôn; chất lỏng đi qua một mặt của vải và ra ngoài, thông qua các nếp gấp , đến một đường ống phục vụ tất cả các đơn vị lọc. Để loại bỏ chất rắn, các tấm phải được tách bằng tay hoặc bán tự động và các tấm vải được làm sạch kỹ lưỡng. Các sợi nấm, vi khuẩn keo tụ và các enzym kết tủa được loại bỏ dễ dàng theo cách này.

Trong bộ lọc trống quay, chân không được đưa vào bên trong của trống rỗng quay trong máng chứa vật liệu cần lọc. Cặn tích tụ trên vải lọc mà từ đó nó có thể được loại bỏ bằng nhiều phương pháp.
Khi một bộ lọc giấy hoặc vải thông thường được thay thế cho một màng có khả năng tách, từ huyền phù hoặc dung dịch, tương ứng, các hạt (bao gồm cả tập hợp phân tử) hoặc đại phân tử có đường kính trung bình nhỏ hơn 5, hoạt động của đơn vị được gọi là vi lọc, siêu lọc, lọc nano, hay thẩm thấu ngược (một loại siêu lọc đặc biệt, trong đó màng chỉ cho phép các phân tử dung môi đi qua). Màng vi lọc có đường kính lỗ trung bình từ 0,05 đến 5, trong khi màng siêu lọc nano và thẩm thấu ngược có đường kính lỗ dao động từ 500 Å đến 5000 Å. Qua đó, các màng này có khả năng tách các chất có MW từ 500 đến 300.000kDa. Các phân tử rất nhỏ đi qua màng và các phân tử lớn được giữ lại trên bề mặt bộ lọc. Các phân tử có kích thước trung gian được giữ lại trong chất nền màng và cuối cùng làm tắc các lỗ chân lông. Vì lý do này, các bộ lọc vi xốp đã được thay thế cho các màng khuếch tán. Thật vậy, màng khuếch tán được hình thành bởi hàng nghìn lớp polyme đặc biệt xếp chồng lên nhau một cách chắc chắn, qua đó các phân tử có MW nhất định có thể xâm phạm từng lớp khi được tác động vào một điện trường - tác dụng qua màng - hoặc gradient nồng độ, áp suất hoặc nhiệt độ. Nói cách khác, siêu lọc về cơ bản là sự khuếch tán phân tử khắp màng. Do đó, sự vận chuyển của một phân tử qua màng đòi hỏi động năng và xảy ra dễ dàng hơn ở nhiệt độ cao. Màng dễ thấm được dễ dàng ngậm nước và bao gồm một polyme có ái lực riêng mạnh với dung môi của nó. Ngược lại, màng cứng tương đối mất nước có tính thấm thấp, đặc biệt khi ái lực giữa polyme màng và dung môi bị giảm.

Theo nghĩa chung nhất, màng tổng hợp là một hàng rào ngăn cách hai pha và hạn chế sự vận chuyển của các chất hóa học khác nhau theo một cách thức cụ thể. Một màng có thể đồng nhất hoặc không đồng nhất, cấu trúc đối xứng hoặc không đối xứng. Nó có thể là trung tính, có thể mang điện tích dương hoặc âm, hoặc có thể là lưỡng cực. Độ dày của nó có thể thay đổi từ dưới 100 nm đến hơn một cm. Điện trở có thể thay đổi từ vài mega ohm đến một phần nhỏ của ohm. Thuật ngữ "màng" bao gồm nhiều loại vật liệu và cấu trúc khác nhau, và màng thường có thể được mô tả tốt hơn về chức năng của nó hơn là về chức năng của nó. Tất cả các vật liệu hoạt động như màng đều có một đặc tính chung: chúng hạn chế sự đi qua của các loại hóa chất khác nhau theo một cách rất cụ thể. Màng không đối xứng là bộ lọc bề mặt và giữ lại tất cả các vật liệu bị loại bỏ ở bề mặt nơi chúng có thể được loại bỏ bằng lực cắt tác dụng bởi dung dịch cấp di chuyển song song với bề mặt màng. Cái gọi là “phân cực màng” là một hiện tượng do sự tích tụ của chất tan bị loại bỏ trên bề mặt màng. Điều này cản trở dòng dung môi, do đó cuối cùng nó có thể không còn phản ứng với sự gia tăng áp suất thủy lực. Do đó, việc thiết kế thiết bị siêu lọc nhằm mục đích giảm thiểu sự tích tụ của các lớp phân cực như vậy, trong thiết bị quy mô nhỏ bằng cách khuấy và trong thiết bị lớn hơn bằng cách duy trì tốc độ dòng chất lỏng cao trên bề mặt màng. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các quy trình màng định hướng áp suất, chẳng hạn như thẩm thấu ngược, siêu lọc hoặc tách khí. Nói cách khác, các ứng dụng của các quá trình này để phân lập enzym - hoặc một dạng phân tử sinh học khác - ở quy mô thí điểm và cấp độ công nghiệp được tập trung vào nồng độ.

Khi các màng vi lọc và siêu lọc đã được phát triển và cải tiến, một thiết bị được gọi là lò phản ứng màng cũng đã được phát triển. Thiết bị này có thể được sử dụng trong các quy trình liên tục bằng enzyme thay thế cho các lò phản ứng thông thường (chủ yếu là lò phản ứng bể khuấy liên tục, lò phản ứng đóng gói hoặc tầng sôi). Theo nguyên tắc chung, các lò phản ứng thông thường hoạt động với enzyme được liên kết với chất hỗ trợ trơ không hòa tan, trong khi lò phản ứng màng có thể hoạt động với enzyme không có trong dung dịch hoặc liên kết với màng (enzyme được giới hạn trên bề mặt hoặc trong màng). lò phản ứng màng có thể được định hình như một lò phản ứng bể khuấy liên tục kết hợp với màng bán thấm hoặc như một lò phản ứng sợi rỗng, tức là một bể chứa không cần khuấy chứa đầy một bó ống sợi rỗng xếp thẳng của màng bán thấm. Tuy nhiên, sự sắp xếp màng / chất xúc tác sinh học có thể liên quan hoặc không tương tác giữa chúng. Nếu như chúng liên kết với nhau, màng đóng vai trò xúc tác và bề mặt ngăn cách đồng thời; nếu không, nó chỉ hoạt động như một bề mặt ngăn cách. Khi enzym ở dạng hòa tan, lò phản ứng màng có thể liên quan đến việc tái chế enzym ( lò phản ứng bể khuấy liên tục và mô-đun màng siêu lọc được kết nối theo chuỗi, thường được gọi là bimodule-lò phản ứng màng) hoặc không (màng siêu lọc được điều chỉnh cho phù hợp với đáy lò phản ứng bể khuấy liên tục như trong một tế bào siêu lọc được khuấy trộn, thường được gọi là unimodule-lò phản ứng màng). Các tính năng hoạt động chính của lò phản ứng màng là xúc tác đồng nhất, hoạt tính cao trên một đơn vị thể tích, không có hiệu ứng cấu tạo và khuếch tán và - nếu cần - lò phản ứng màng có thể được vận hành trong điều kiện vô trùng cũng như với các hệ thống đa enzym. Những tính năng đó đang dần chuyển đổi sở thích của ngành từ các lò phản ứng enzym cố định truyền thống (lò phản ứng đóng gói hoặc tầng sôi và lò phản ứng bể khuấy liên tục ) sang lò phản ứng màng. Xu hướng này sinh ra khi sử dụng lò phản ứng màng trong hàng chục quy trình, dẫn đến nhiều loại sản phẩm (axit gluconic, glucose, fructose, cyclodextrins, cathecol, v.v.)

Ly tâm và lắng.
Các hoạt động đơn vị này đều dựa trên sự khác biệt về mật độ giữa các hạt không hòa tan và chất lỏng xung quanh. Quá trình lắng dựa vào trọng lực, lắng để đạt được sự phân tách rắn-lỏng, và thường được thực hiện trong các bể dòng chảy hình chữ nhật hoặc hình tròn. Ly tâm liên quan đến việc áp dụng cơ học của lực ly tâm để thu được chất cô đặc rắn và phần nổi phía trên được làm rõ.
Ly tâm đã trở thành một kỹ thuật phổ biến để loại bỏ chất rắn, đặc biệt trong những trường hợp lọc không mong muốn hoặc không hiệu quả (chẳng hạn như loại bỏ vật liệu dạng keo hoặc sền sệt).
Có một số loại máy ly tâm để phân lập enzyme. Máy ly tâm bát dạng ống, máy ly tâm nhiều buồng, máy ly tâm đĩa, máy ly tâm cuộn bát đặc và máy ly tâm giỏ đục lỗ được sử dụng chủ yếu.

Khi lực ly tâm mạnh hơn lực hấp dẫn hàng nghìn lần, ví dụ 500.000 lần, thì hoạt động của bộ siêu ly tâm xảy ra. Khi các dung dịch keo được đặt trong các ô của rôto siêu ly tâm (quay khoảng 60.000 lần / phút), chúng phải chịu một lực phụ thuộc vào vận tốc góc của rôto và khoảng cách của các hạt keo so với trục quay. Tốc độ chuyển động của các hạt phụ thuộc vào lực này, hình dạng, kích thước và mật độ của các hạt cũng như mật độ và độ nhớt của môi trường huyền phù. Đối với các chất đồng nhất, trong đó các hạt giống nhau, các hạt chuyển động với lực ly tâm theo một ranh giới sắc nét trong môi trường, trong khi hỗn hợp của các loại hạt khác nhau cung cấp nhiều ranh giới và vùng mờ. Siêu ly tâm được sử dụng trong việc tách các phân đoạn ti thể, microomal và hạt nhân từ các tế bào mô bị gián đoạn, cũng như trong việc tách và tinh chế các protein vi rút trộn lẫn với các protein mô.

 Keo tụ và đông tụ.
Sự đông tụ là kết quả của sự kết dính trực tiếp giữa các hạt rất nhỏ trong môi trường do sự trung hòa điện tích của các hạt bằng cách thêm các ion đa hóa trị có điện tích trái dấu (muối vô cơ hoặc polyelectrolyte hữu cơ), do đó cho phép kết tụ.
Keo tụ là sự hình thành các tập hợp rất hở, trong đó chất tạo bông (gelatin, polyme tổng hợp tích điện hoặc không tích điện) hoạt động như một cầu nối mở rộng giữa các hạt. Các ion vô cơ không thể gây keo tụ, mặc dù chúng có thể được sử dụng để trung hòa điện tích và hỗ trợ quá trình keo tụ. Tuy nhiên, các chất polyelectrolytes hữu cơ có thể gây ra hiện tượng đông tụ và tạo bông đồng thời.
Những kỹ thuật này đã được áp dụng cho toàn bộ tế bào, mảnh vụn tế bào và protein không hòa tan (bao gồm cả enzyme).

 Sự gián đoạn tế bào.
Nếu sản phẩm mong muốn là một chất nội bào (ví dụ, glucose 6-phosphate dehydrogenase từ Saccharomyces cerevisiae), thì sự phá vỡ tế bào là một bước đầu quan trọng trong quá trình thu hồi sản phẩm bởi vì các lớp bao bọc tế bào (màng tế bào chất và thành tế bào) là những rào cản tự nhiên để giải phóng đại phân tử vào môi trường nuôi cấy. Các phương pháp được sử dụng để phá vỡ vi sinh vật có thể được phân loại là cơ học (đông lạnh / rã đông, siêu âm, máy nghiền dyno và keo, máy ép Gaulin / Manton và Pháp, máy nghiền bi) và phi cơ học (xử lý bằng kiềm, chất tẩy rửa hoặc dung môi hữu cơ, sốc thẩm thấu, đông lạnh - sấy khô, tiêu hóa bằng enzym, v.v.). Hiệu quả của một kỹ thuật phá vỡ cụ thể thường được đánh giá dựa trên mức độ phá vỡ tế bào và / hoặc mức độ hoạt động của enzym được phục hồi, hoặc tổng số protein hòa tan trong huyền phù bị phá vỡ. Mặc dù bước phá vỡ tế bào bổ sung làm tăng thêm chi phí sản xuất các chất nội bào so với các sản phẩm ngoại bào, nhưng đây không phải là một nhược điểm. Đối với việc sản xuất các sản phẩm có giá trị cao từ vi sinh vật, cũng như từ các mô thực vật hoặc động vật, chi phí tăng thêm ít quan trọng. Hơn nữa, chi phí sản xuất có thể được giảm xuống bằng cách cô lập đồng thời một số sản phẩm sau quá trình phá vỡ tế bào và / hoặc hòa tan trong môi trường lên men.

 Khai thác.
Chiết xuất là một thuật ngữ chung có nghĩa là phân lập enzym từ dịch chiết không có tế bào thô. Việc phân lập có thể được thực hiện thông qua siêu lọc - một quy trình phân tách trực tiếp; chỉ cần sử dụng một màng có độ cắt thích hợp để giữ lại enzyme mong muốn hoặc các sản phẩm phụ không mong muốn chiết xuất bằng dung môi hoặc hệ thống hai pha trong nước.
Chiết xuất các chất ưa béo bằng dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước là một quá trình tách rời được thiết lập tốt trong ngành công nghiệp hóa chất, có thể được thực hiện trên quy mô lớn. Chiết xuất cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc phân lập kháng sinh. Quá trình chiết xuất kháng sinh điển hình liên quan đến việc chuyển chất tan từ môi trường lên men đã được làm rõ sang pha hữu cơ, tiếp theo là chiết xuất lại sản phẩm cô đặc trong dung dịch đệm nước. Do đó, quy trình hai bước kết hợp cô đặc sản phẩm với quá trình tinh chế. Thu hồi cuối cùng thường đạt được bằng cách kết tủa, kết tinh hoặc bay hơi.

Quá trình chiết hai pha trong nước cho phép tách các enzym khỏi hỗn hợp các phân tử sinh học trong điều kiện nhẹ. Kỹ thuật này dựa trên sự phân chia các phân tử sinh học giữa hai pha lỏng xuất hiện khi hai polyme không tương thích - chẳng hạn như polypropylene glycol và hydroxypropyldextran - được hòa tan vào nước, với một polyme chiếm ưu thế trong mỗi pha. Tương tự, có thể xảy ra hai pha nước khi cho polyme vào dung dịch muối nước trên một nồng độ nhất định. Khi một hỗn hợp các phân tử sinh học, ví dụ, môi trường lên men, dịch nuôi cấy tế bào nổi hoặc huyền phù của các tế bào bị gián đoạn, được thêm vào hệ thống hai pha nước, mỗi loại phân tử sinh học sẽ phân chia duy nhất giữa hai pha. Ưu điểm của hệ thống này là tính tương thích sinh học cao và độ căng bề mặt thấp, độ phân giải và năng suất cao, tăng quy mô tuyến tính lên khoảng 2x104 lần so với quy mô phòng thí nghiệm và sử dụng trực tiếp công nghệ kỹ thuật hóa học có sẵn (thiết bị chiết lỏng-lỏng) cho sự phân tách quy mô công nghiệp.

Phân vùng ái lực, như đã đề cập ở trên, dựa trên sự tương tác ưu tiên giữa phân tử và một phối tử cụ thể. Sự tương tác dẫn đến một phức hợp phối tử-phân tử sinh học phân chia có chọn lọc vào một trong các pha, để lại các chất hoặc protein gây ô nhiễm trong pha còn lại. Ví dụ, glucose-6-phosphate dehydrogenase từ men làm bánh được tinh chế 2,4 lần với hiệu suất 67% trong hệ thống hai pha nước với sự hiện diện của thuốc nhuộm triazine.

Một biến thể của hệ thống được mô tả là chiết lỏng-lỏng bằng các mixen đảo ngược, một công cụ hữu ích và linh hoạt khác để tách các enzym. Hệ thống micelle đảo ngược bao gồm tập hợp các phân tử chất hoạt động bề mặt có chứa lõi nước bên trong được phân tán trong môi trường dung môi hữu cơ. Môi trường vi phân cực bên trong micelle đảo ngược cho phép hòa tan protein trong khi vẫn duy trì cấu trúc ban đầu của nó. Quá trình này được tiến hành theo hai bước, tức là chiết xuất thuận, trong đó protein mục tiêu được chuyển từ dung dịch nước sang pha hữu cơ dạng micelle đảo ngược, và chiết xuất ngược lại, qua đó protein được chuyển từ các mixen đảo ngược sang pha nước mới. từ đó nó được phục hồi sau đó. Sự phân tách cũng có giá trị nếu protein đích vẫn còn trong pha nước và các chất gây ô nhiễm chuyển sang các mixen đảo ngược. Trong trường hợp này, việc thanh lọc đơn giản và kinh tế hơn vì đã loại bỏ được bước chiết xuất sau. Do bản chất tĩnh điện của sự tương tác giữa protein / các mixen đảo ngược, cường độ ion của dung dịch nước đóng một vai trò quan trọng trong hiệu quả của quá trình chiết lỏng-lỏng. Bằng cách thay đổi cường độ ion của môi trường một cách thuận tiện, protein có thể được chuyển đến hoặc loại bỏ khỏi micelle đảo ngược, tương ứng, ở cường độ ion thấp hoặc cao. Một quan điểm tốt là áp dụng kỹ thuật này trực tiếp trong chất đồng nhất của vi sinh vật thô nhằm mục đích loại bỏ một loại enzyme hoặc protein cụ thể. Ví dụ, các enzym xylose reductase và xylitol dehydrogenase, được tinh chế bằng hệ số 4,8 và 2,3, tương ứng, được tách trực tiếp khỏi chất đồng nhất không có tế bào thô bằng các micelle đảo ngược của N-Benzyl-N-Dodecyl-N-bis (2- hydroxyetyl) amoni clorua (BDBAC) chất hoạt động bề mặt cation.

Sự kết tủa.
Đây là một quy trình trong đó việc thêm thuốc thử hoặc thay đổi điều kiện làm cho protein rời khỏi dung dịch và tạo thành các hạt không hòa tan.
Có một số cách để thực hiện kết tủa đại phân tử: a) muối hóa: kết tủa protein bằng cách sử dụng muối trung tính - chủ yếu là amoni và natri sunfat - ở nồng độ cao; b) Sự thay đổi pH: nhằm mục đích kết tủa protein tại điểm đẳng điện của nó (pH mà điện tích chung của đại phân tử bằng không); c) tempera sự thay đổi chắc chắn: nhiệt độ được tăng lên từ từ để thúc đẩy sự biến tính của các protein không mong muốn, và protein mong muốn vẫn bị hòa tan; d) kết tủa bằng dung môi hữu cơ (etanol, metanol, axeton hoặc dietyl); e) sự kết tủa bằng polyme có khối lượng phân tử cao: nó dựa trên ảnh hưởng của polyme đối với sự tương tác của protein với môi trường nước của nó. Hiện tượng xảy ra do sự chèn của polyme vào mặt phân cách protein-nước. Polyetylen glycol 6000 MW (PEG 6000), được trộn với nước ở nồng độ 50% (wt / wt), là chất kết tủa và ổn định protein hiệu quả ở nhiệt độ phòng. Hơn nữa, nó là một thuốc thử rẻ tiền, có sẵn trên thị trường, và nó không cần phải loại bỏ trước khi hấp phụ trao đổi ion - nếu quy trình xuôi dòng dự đoán rằng sẽ có kết tủa sau quy trình sắc ký này; và, f) kết tủa bằng muối mangan hoặc streptomycin sulfat: quy trình này nhằm mục đích loại bỏ axit nucleic khỏi dịch chiết không tế bào trong việc cô lập các enzym nội bào vì sự hiện diện của axit nucleic (MW từ 25x103 đến 1x106) làm tăng độ nhớt trung bình, làm giảm năng suất của sự phân tách trong kết tủa phân đoạn và / hoặc sắc ký.

 Sắc ký.
Sắc ký có thể được định nghĩa là sự thấm đều của chất lỏng qua một cột chứa đầy chất được phân chia mịn có thể làm chậm một cách chọn lọc các thành phần nhất định của chất lỏng. Để phân lập enzyme, phần lớn các phép tách sắc ký được thực hiện trong môi trường nước hoàn toàn.
Có một số phương pháp sắc ký để tách hoặc tinh chế các sản phẩm sinh học. Các phương pháp chính là a) sắc ký trao đổi ion: điện tích phân tử là cơ sở của sự phân tách; hiệu quả của nó là đáng chú ý ở giai đoạn đầu hạ nguồn, nơi xử lý khối lượng lớn; độ phân giải, khả năng lưu giữ và tốc độ phụ thuộc vào chất nền được sử dụng (ví dụ như chất đồng trùng hợp divinyl-styren, xenluloza kết tinh hoặc dextran); nó có thể được sử dụng theo lô hoặc với các quy trình liên tục; b) sắc ký tương tác kỵ nước: theo sau lực Van der Waals và tương tác steric giữa chất tan và chất nền (ví dụ như phenyl agarose); độ phân giải, khả năng lưu giữ và tốc độ có liên quan; nó có thể được áp dụng ở bất kỳ giai đoạn nào của quy trình hạ lưu, mặc dù sự phân tách lớn nhất xảy ra khi cường độ ion của môi trường cao, chủ yếu sau khi ngâm muối; c) lọc gel: khả năng phân tách dựa trên kích thước và hình dạng của các chất tan liên quan đến đường kính hạt hình cầu gel, để các phân tử chất tan nhỏ đi vào các hạt và đi qua một thể tích lưu giữ hiệu quả lớn hơn trong khi các phân tử lớn nhất bao quanh các hạt nổi lên trước. từ cột gel; thông lượng qua cột cao, nhưng có độ phân giải vừa phải để phân đoạn; nó hiệu quả để khử muối và trao đổi bộ đệm; d) Sắc ký ái lực: dựa trên ái lực sinh học, độ chọn lọc, khả năng lưu giữ và tốc độ của chúng phụ thuộc vào loại phối tử được sử dụng (kháng thể đơn dòng, chất ức chế đặc hiệu, đồng yếu tố, cơ chất biến tính, v.v.); nếu phối tử bị cố định bằng cách gắn cộng hóa trị vào chất nền không hòa tan (xenluloza hoặc polyacrylamit), thì protein quan tâm, khi thể hiện ái lực với phối tử của nó, sẽ trở nên liên kết và tự cố định. Khi các protein tạp nhiễm được loại bỏ bằng cách lọc và rửa sạch chất nền, protein quan tâm sẽ được rửa giải khỏi chất nền bằng cách bổ sung nồng độ cao của phối tử tự do trong dung dịch; mặc dù nó có thể được sử dụng ở bất kỳ giai đoạn nào của quy trình hạ lưu, khuyến nghị là sử dụng nó khi lượng protein và các chất gây tắc nghẽn đã được giảm mạnh bởi các quy trình khác rẻ hơn.

 Kết tinh.
Tinh thể là những thể được hình thành do sự đông đặc trong điều kiện thuận lợi của một nguyên tố hóa học, một hợp chất hoặc một hỗn hợp đẳng hình với sự sắp xếp bên trong thường xuyên lặp lại của các nguyên tử của nó.
Kết tinh là một quá trình - được thực hiện trong lô hoặc máy kết tinh liên tục - trong đó một chất kết tinh từ dung dịch quá bão hòa. Điều này có thể đạt được bằng cách làm lạnh dần dung dịch xuống dưới nhiệt độ bão hòa hoặc bằng cách làm bay hơi dung môi ở nhiệt độ không đổi trên nồng độ bão hòa của chất. Làm bay hơi đơn giản là một kỹ thuật hữu ích để các enzym không bị tổn hại bởi sự gia tăng nồng độ của các chất tan có MW thấp và nó cũng ổn định ở nhiệt độ cao cần thiết để quá trình xảy ra với tốc độ đáng kể. Kết tinh là phương pháp ưa thích để tạo thành sản phẩm cuối cùng vì độ tinh khiết rất cao là khả thi. Các tinh thể enzyme tinh khiết để phân tích tinh thể hoặc sử dụng trong dược phẩm (lysozyme, hyaluronidase, superoxide dismutase, urokinase, uricase, v.v.) có thể thu được từ dung dịch đã được khử trùng trước đó hoặc không bằng phương pháp siêu lọc. Khi có thời gian để đạt đến trạng thái cân bằng, độ tinh khiết của tinh thể sẽ cao nếu không thì độ tinh khiết sẽ nghèo.
Quá trình tạo muối thông thường của một enzym với amoni sulfat không thể được coi là một loại kết tinh vì kết tủa là một bánh vô định hình của các phân tử enzym chứ không phải của các thực thể kết tinh.
Kết tinh là quy trình tinh chế cuối cùng cho phép thu được các sản phẩm cuối cùng (protein, enzym, hóa chất tốt, v.v.) với độ tinh khiết vượt trội, dễ xử lý, thời hạn sử dụng lâu dài và hình thức dễ chịu. Cấu trúc ba chiều chi tiết của khoảng tám trăm protein đã được thiết lập bằng phương pháp tinh thể học tia X (chùm tia X được truyền qua một tinh thể của protein).

 Làm khô.
Trước khi xử lý, đóng gói và lưu trữ, các sản phẩm sinh học tinh khiết phải không có nước hoặc dung môi hữu cơ còn sót lại. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sấy phun và sấy đông lạnh. Cả hai kỹ thuật đều cho phép loại bỏ nước hoặc dung môi khác một cách nhẹ nhàng với nhiệt độ tăng tối thiểu. Sự truyền nhiệt có thể bằng dẫn truyền, đối lưu, bức xạ hoặc sự kết hợp của chúng.

Sấy phun là một phương pháp làm khô đối lưu được thực hiện bằng máy sấy phun trong đó sử dụng máy phun áp lực hoặc ly tâm hoặc các tia khí-lỏng để tạo ra các giọt dung dịch phun mịn khi tiếp xúc liên tục với khí nóng chảy xoáy trong buồng hình nón (100- 300độ C). Kích thước của buồng sấy phải sao cho các giọt nước không chạm vào thành cho đến khi chúng đủ khô để tránh bị dính và cháy. Khi thời gian sấy khoảng vài giây, nhiệt độ của các hạt vẫn ở mức thấp. Bột khô tích tụ ở đáy buồng từ nơi nó được lấy ra. Những ưu điểm chính của quá trình này là hoạt động liên tục, tạo ra các sản phẩm sinh học dạng bột và xử lý các vật liệu không bền nhiệt mà không làm mất đi đáng kể các tính năng chính của chúng như cấu trúc phân tử (đối với các chất tạo màng sinh học như DNA, RNA, polysaccharide, protein và lipid), hoạt tính xúc tác (đối với enzym), khả năng hoạt động bề mặt (đối với protein không xúc tác), và hoạt tính dược lý (đối với thuốc).

Làm khô đông lạnh nhằm mục đích chuyển vật liệu sinh học từ dạng hoạt động thành dạng không hoạt động bằng cách đóng băng (tốc độ làm lạnh từ 0,5 độ C / phút đến 5 độ C / phút) sau đó loại bỏ nước dưới áp suất thấp (thường từ 0,1 đến 0,5mbar) và nhiệt độ được kiểm soát (thường từ 15 độ C đến 30 độc C). Làm khô đông lạnh dựa trên thực tế là nước đông lạnh thăng hoa thành hơi nước dưới áp suất thấp. Nhiệt được truyền đến chất rắn đông lạnh chủ yếu bằng cách dẫn từ một tấm gia nhiệt, hơi nước ngưng tụ ở nhiệt độ thấp (bình ngưng duy trì ở -40 độ C), và nhiệt độ chất rắn được điều chỉnh bằng cách kiểm soát áp suất trong buồng sấy. Quá trình này có thể được chia thành sấy sơ cấp và sấy thứ cấp. Sấy sơ cấp loại bỏ nước tự do (khoảng thời gian từ 10 đến 20 h), và sấy thứ cấp (thời gian khoảng một phần ba thời gian làm khô sơ cấp) loại bỏ độ ẩm (ví dụ, nước kết tinh hoặc nước phân tán trong vật liệu thủy tinh). Mục đích của đông khô là thu được chất rắn có hàm lượng ướt tương đương với độ ẩm đơn lớp - cái gọi là hoạt độ nước - được tính toán từ các đường đẳng nhiệt hấp thụ nước bằng cách áp dụng các mô hình toán lý hóa đúng cách. hoạt độ nước có thể được coi là lượng nước tối thiểu mà vật liệu đông khô giữ được tính năng chức năng chính của nó (ví dụ, một loại enzyme sẽ duy trì khả năng xúc tác của nó, khả năng phát triển của tế bào, một loại thuốc có hoạt tính dược lý và một loại thực phẩm được bảo tồn kéo dài thời gian). Người ta đã báo cáo rằng nấm men đông khô có hoạt độ nước từ 0 đến 0,33 (xấp xỉ giá trị độ ẩm đơn lớp) để ở 25 độ C trong 235 ngày và ở 89 độ C trong 15 phút giữ lại ít nhất 85% hoạt tính invertase ban đầu của nó, trong khi các mẫu có hoạt độ nước cao hơn giá trị hàm lượng ẩm một lớp làm mất ít nhất 60% hoạt tính invertase của nó. [14] Sự thành công của quá trình đông khô phụ thuộc vào các điều kiện mà bước đông lạnh được thực hiện (bản chất hóa học của chất đệm, độ pH, tốc độ làm lạnh, và sự có mặt hay không có mặt của các chất bảo vệ lạnh như glycerol và polyethylene glycol 400). Đây là phương pháp nhẹ nhàng nhất trong các phương pháp làm khô. Thu được bột mịn và dễ hòa tan. Tuy nhiên, phương pháp này có những nhược điểm như đầu tư vốn cao và chi phí năng lượng, thời gian xử lý lâu, dễ hình thành hỗn hợp bọt và eutectic. Hơn nữa, sự bất hoạt của các enzym có cấu trúc bậc bốn và các thụ thể protein của tế bào có thể xảy ra.

Phối trộn.
Công thức là cách một chế phẩm enzyme - ở dạng dung dịch hoặc dạng bột có thể được bán trên thị trường.
Bản chất và độ tinh khiết của chế phẩm sẽ được xác định bởi các yêu cầu của ngành. Các enzym được sử dụng trong công nghiệp yêu cầu độ tinh khiết tối thiểu và trong trường hợp có chất xúc tác ngoại bào vi sinh vật, chất nổi không có tế bào đông khô được xử lý để loại bỏ các thành phần có màu được chấp nhận. Đối với các enzym công nghiệp, quy trình hạ nguồn được thiết kế để tăng hiệu lực xúc tác trên mỗi trọng lượng và không đạt được độ tinh khiết - vì trong công nghiệp, việc giảm chi phí là then chốt, nên độ tinh khiết của enzym phải ở mức tối thiểu. Trong một số trường hợp, các chế phẩm hỗn hợp của các enzym được yêu cầu - ví dụ, amylase cộng với protease trong sản xuất nước dùng nấu bia và kích cỡ hàng dệt, glucose oxidase và catalase để loại bỏ các vết glucose trong một số thực phẩm nhất định (trứng khô) -, trong các trường hợp khác , hỗn hợp không mong muốn (amylase của nấm làm phụ gia bột mì phải không chứa protease, nếu không các axit amin hòa tan sẽ được giải phóng khỏi protein và gây ra quá nhiều bọt và chuyển sang màu nâu). Mặt khác, các enzym dược phẩm (ví dụ như asparaginase, hyaluronidase) phải không chứa pyrogen và các enzym dùng trong xét nghiệm lâm sàng không được chứa các enzym cản trở kết quả xét nghiệm. Vì chi phí nguyên liệu và lên men tương đối thấp, nên tỷ lệ phần trăm thu hồi tổng thể là rất quan trọng. Ví dụ: nếu một giao thức xuôi dòng năm bước được thực hiện với năng suất 90% cho mỗi bước, thì mức khôi phục cuối cùng sẽ là 0,95 hoặc 60%. Việc sử dụng enzym hiệu lực cao có những ưu điểm như ít bị thất thoát do rơi vãi trong quá trình sử dụng và chi phí đóng gói và vận chuyển thấp.

Các nhà sản xuất enzym công nghiệp tạo ra sản phẩm cuối cùng với các chất phụ gia (chất đệm, chất ổn định và chất kháng khuẩn), không chỉ nhằm mục đích tăng thời hạn sử dụng và độ ổn định của enzym, mà còn để tăng khối lượng, tiêu chuẩn hóa hoạt tính xúc tác của chế phẩm, và làm cho sản phẩm dễ quản lý hơn (có nghĩa là đơn giản hơn nếu thêm 10 kg enzym vào bể xử lý hơn 10 g).

 PHẦN KẾT LUẬN:
Quy trình hạ nguồn phải được thiết kế để thu được các enzym có độ tinh khiết thích hợp. Các enzym nội bào, không phụ thuộc vào nguồn, luôn luôn yêu cầu sự phá vỡ tế bào ngay từ bước đầu tiên. Mcerate được lọc, ly tâm hoặc keo tụ để tách các mảnh vụn tế bào. Sau đó, phần nổi phía trên được xử lý với sự kết hợp của các hoạt động hạ nguồn theo độ tinh khiết mà ứng dụng enzym yêu cầu. Các enzym công nghiệp yêu cầu mức độ tinh khiết thấp hoặc trung bình, trong khi các enzym điều trị và phân tích phải có độ tinh khiết cao. Độ tinh khiết cao có thể đạt được bằng cách xử lý dung dịch enzym thu được từ các quy trình tinh chế thô trước đó (lọc và / hoặc kết tủa) với ít nhất hai kỹ thuật sắc ký. Các bước ban đầu liên quan đến sản xuất enzym ngoại bào của vi sinh vật bao gồm lọc huyền phù tế bào, sau đó là cô đặc dịch lọc. Do đó, với khối lượng dịch lọc nhỏ, các hoạt động hạ nguồn tiếp theo sẽ được thuận lợi hơn cả về kích thước thiết bị và quy trình xử lý. Các hoạt động hoàn thiện (làm khô, pha chế và đóng gói) cũng là khâu then chốt để ổn định chế phẩm enzyme với thời hạn sử dụng ít nhất là một năm. Thời hạn sử dụng dài rất quan trọng đối với các enzym được sử dụng làm thuốc hoặc trong các quy trình phân tích.

Nguồn: researchgate.net
Biên dịch: Ecovet Team